Human telomerase catalytic subunit(hTERT)유전자의 promoter에 작용하는 암세포특이성 전사인자의 규명및 암조직에서의 hTERT조절기전 연구

Abstract

1)1차년도에 검색된 대상유전자(암조직에서 발현양이 정상조직의 경우에 비해 유의성있게 변화된 경우) 중 선별된 전사인자를 대상으로 full coding sequence를 cloning ①암특이 발현변화 전사인자군의 확인 -ELF3, PDEF, ESE3, SP1, TIFF1, TIFF2, MAZ, PEA3, AP2, EGR1, GCF, E2F4, Znf6, Znf133, Znf220, RBBP4, E1AF, Ets2, CREG, MSX1, MAZ등을 비롯한 전사인자들을 cDNA microarray방법에 의해 위암조직에서 정상위점막조직과 상대적으로 발현량이 유의하게 변화하는 것으로 확인된 전사인자군으로서 이들 중 일부의 전사인자들에 대해서 RT PCR방법으로 그 발현량이 위암조직에서 정상위점막조직과 비교할 때 상대적으로 증감하는 현상을 확인하였다. RT PCR은 TAKARA EX Taq polymerase를 사용해서 20회, 30회, 40회 및 50회로 PCR횟수를 증가시켜감에 따른 몇가지 전사인자들의 발현도가 위암조직과 정상 위점막조직에서 틀린 지의 여부를 관찰하였다. cDNA microarray방법에 의해 위암조직과 정상위점막조직에서 유의성있게 발현량이 틀린 것으로 확인되었던 이들 인자들 중 대부분의 경우 RT PCR결과 위암조직에서 그 발현도에 있어 뚜렷한 증감을 나타내지는 않았으나 위암조직에서 현저한 발현량 차이를 나타내는 몇가지 인자들도 확인되었다. 이들 인자는 위암세포주를 비롯해서 유방암세포주, 간암세포주, 췌장암 세포주, 전립선암세포주, 자궁경부암세포주, 골육종 세포주, 망막아종세포주, 백혈병 세포주등을 대상으로 이들 세포에서의 발현도를 조사함으로써 암세포주에서 일반적으로 발현되는 것인지와 세포주에 따라 발현이 틀린 지의 여부를 확인하고자 하였다. ②해당 전사인자의 full cDNA cloning 및 mammalian expression vector로의 subcloning 위암조직에서 뚜렷한 차이를 나타내는 몇가지 전사인자들에 대해서는 현재 그 cDNA를 cloning하여 mammalian expression벡터인 pCIneo로 삽입하는 작업을 수행 중이다. 이들 인자는 pGL3basic벡터에 삽입된 hTERT promoter유전자와 함께 AGS, MCF7, SaOS2등의 세포주를 대상으로 cotransfection하여 Firefly luciferase assay를 시행함으로써 hTERT발현도에 영향을 미치는 지를 조사할 예정이다. ③hTERT promoter에 대한 reporter assay-luciferase assay 현재 endogenous telomerase가 발현되는 세포주로서 AGS 및 MCF7세포주를 대상으로 hTERT promoter의 전체 부분과 부분삭제된 hTERT promoter를 이용하여 조사대상에 해당되는 전사인자들의 hTERT발현조절여부를 조사하고 있으며 동시에 hTERT-negative cell로서 SaOS2세포주에도 특정 인자의 mammalian expression construct를 hTERT promoter construct와 함께 cotransfection하여 reporter assay를 시행함으로써 hTERT전사조절능 여부를 분석하고 있다. 대상 세포주의 telomerase발현 여부는 telomerase발현을 위한 세포주의 전사환경을 나타내는 것이므로 특정전사인자가 특정세포주에서 과발현되었을 때 telomerase발현 전사환경이 갖추어진 세포주에서는 hTERT발현도에 미치는 특정인자의 영향력이 현저하게 나타날 수도 있고 반대로 영향이 미미할 수도 있는데 현저한 영향을 주는 인자의 경우 그 세포주의 telomerase전사환경에 적당한 인자로 판단될 수 있다. Telomerase발현이 되지 않는 세포주에서의 특정인자 과발현이 hTERT발현에 미치는 영향력은 telomerase가 발현되는 전사환경을 갖춘 세포주의 경우와 비교할 때 hTERT promoter에 미치는 효과가 보다 직접적일 것으로 판단된다. 2)hTERT promoter에 대한 E1A인자의 영향 ①MCF7세포주의 경우 본 실험에서 현재까지 수행된 몇가지 인자에 대한 연구 중 hTERT promoter에 대해 뚜렷한 영향을 주는 것으로 확인된 E1A인자의 경우, p53에 의해 hTERT발현에 미치는 영향이 조절되는 것으로 나나났다. p930벡터에 삽입된 E1A와 pcDNA3.1에 삽입된 p53을 이용한 luciferase assay 결과 유방암세포주인 MCF-7에서 E1A가 hTERT발현을 26.6배 증가시키고 p53은 hTERT발현에 대해 1.2배~1.6배 증가시켰으나 E1A와 p53의 cotransfection시 E1A에 의한 hTERT발현증가가 1.1배 정도로서 E1A단독 과발현시의 hTERT발현도 증가치였던 26.6배가 현저히 억제되었다. p53의 돌연변이 유전자를 사용한 경우 125번, 245번, 248번 및 272번 아미노산이 각기 변이된 p53mt125, p53mt245, p53mt248 및 p53mt272유전자의 경우 E1A와 cotransfection시 hTERT발현도 증가치가 각기 5.5배, 4배, 5.2배 및 5.6배로서 돌연변이되지 않은 정상p53유전자에 의한 E1A의 hTERT발현촉진 억제효과가 감소되었다. 따라서 MCF 7세포주에서 p930벡터에 삽입된 E1A는 hTERT발현을 촉진하지만 pcDNA3.1에 삽입된 p53은 hTERT발현을 촉진하는 E1A의 작용을 억제하는 것으로 나타났다. Luciferase assay시 E1A 및 p53을 cotransfection하였을 때 E1A 및 p53의 벡터가 틀린 경우 벡터 자체에 의한 luciferase activity간섭현상이 심각하여 E1A 및 p53을 동일한 벡터인 pCIneo로 각기 삽입한 뒤 MCF7세포주를 대상으로 cotransfection하여 luciferase assay를 시행하였다. 이 경우 E1A에 의한 hTERT발현도 증가는 5.5배 정도였으며 E1A와 정상p53 또는 p53mt125, p53mt245, p53mt248 및 p53mt272(pCIneo에 삽입된 돌연변이 p53유전자)의 cotransfection시, hTERT발현도 증가는 각기 3.1배, 3.9배, 3.1배, 2.7배 및 3.2배로서 정상p53유전자와 돌연변이 p53유전자가 E1A에 의한 hTERT발현도 증가를 억제하는 정도가 비슷하였다. 이는 125번, 245번, 248번 및 272번 아미노산의 돌연변이가 p53유전자의 전사인자 작용을 억제한다는 사실에 입각할 때 p53이 E1A의 hTERT발현도 증가 작용을 억제하는 것은 p53자체의 전사인자 작용이기보다 p53과 관련된 다른 전사인자가 E1A에 작용할 가능성을 나타낸다. hTERT promoter의 염기서열이 부분삭제된 deletion constructs를 이용한 MCF7세포주에서의 luciferase assay결과 hTERT promoter전체부분(-1659번부터 34번 염기까지)에 대한 E1A의 hTERT발현도 증가가 9.1배였고 p53에 의해 억제된 E1A의 hTERT발현도 증가가 5배로서 45%감소된 것과 비교할 때, hTERT promoter의 -1240번부터 34번 염기까지의 부분에 있어서 E1A의 hTERT발현도 증가가 3.3배였고 p53에 의해 억제된 E1A의 hTERT발현도 증가가 2.2배로서 33%감소하였다. hTERT promoter의 -941번부터 34번 염기까지의 부분에 있어 E1A의 hTERT발현도 증가가 5.4배였고 p53에 의해 억제된 E1A의 hTERT발현도 증가가 3.1배로서 43%감소하였다. hTERT promoter의 -1037번부터 -248번 염기서열이 삭제된 나머지 부분에 있어 E1A의 hTERT발현도 증가가 3.9배였고 p53에 의해 억제된 E1A의 hTERT발현도 증가가 4.9배로서 26%증가하였다. hTERT promoter의 -1016번부터 -53번 염기서열이 삭제된 나머지 부분에 있어 E1A의 hTERT발현도 증가가 6.9배였고 p53에 의해 억제된 E1A의 hTERT발현도 증가가 3.8배로서 45%감소하였다. hTERT promoter의 -247번부터 34번 염기 사이의 부분에 있어 E1A의 hTERT발현도 증가가 7.2배였고 p53에 의해 억제된 E1A의 hTERT발현도 증가가 6.1배로서 15%감소하였다. hTERT promoter의 -80번부터 34번 염기 사이의 부분에 있어 E1A의 hTERT발현도 증가가 8.1배였고 p53에 의해 억제된 E1A의 hTERT발현도 증가가 4.7배로서 42%감소하였다. hTERT promoter의 -25번부터 34번 염기 사이 부분에 있어 E1A의 hTERT발현도 증가가 7.1배였고 p53에 의해 억제된 E1A의 hTERT발현도 증가가 4.9배로서 31%감소하였다. 이상의 결과로부터 p53이 E1A의 hTERT발현 촉진을 억제하는 효과는 최소한 hTERT promoter의 -1037번부터 -248번 염기사이 부분과 -25번과 34번 염기사이 부분에 관련되는 것으로 판단된다. ②AGS세포주의 경우 위암세포주인 AGS세포를 대상으로 한 luciferase assay결과 hTERT promoter전체부분(-1659번부터 34번 염기까지)에 대한 E1A의 hTERT발현도 증가가 10.6배였고 p53및 E1A의 hTERT발현도 증가가 12.9배로서 22%증가된 것으로 나타났고, hTERT promoter의 -1240번부터 34번 염기까지의 부분에 있어서 E1A의 hTERT발현도 증가가 10.2배였고 p53 및 E1A의 hTERT발현도 증가가 8.8배로서 14%증가하였다. hTERT promoter의 -941번부터 34번 염기까지의 부분에 있어 E1A의 hTERT발현도 증가가 11.3배였고 p53에 의해 억제된 E1A의 hTERT발현도 증가가 12배로서 63%감소하였다. hTERT promoter의 -1037번부터 -248번 염기서열이 삭제된 나머지 부분에 있어 E1A의 hTERT발현도 증가가 10배였고 p53및 E1A의 hTERT발현도 증가가 11배로서 9%증가하였다. hTERT promoter의 -1016번부터 -53번 염기서열이 삭제된 나머지 부분에 있어 E1A의 hTERT발현도 증가가 14.5배였고 p53에 의해 억제된 E1A의 hTERT발현도 증가가 13.4배로서 8%감소하였다. hTERT promoter의 -247번부터 34번 염기 사이의 부분에 있어 E1A의 hTERT발현도 증가가 7.5배였고 p53및 E1A의 hTERT발현도 증가가 11배로서 32%증가하였다. hTERT promoter의 -80번부터 34번 염기 사이의 부분에 있어 E1A의 hTERT발현도 증가가 10.6배였고 p53및 E1A의 hTERT발현도 증가가 16배로서 51%증가하였다. hTERT promoter의 -25번부터 34번 염기 사이 부분에 있어 E1A의 hTERT발현도 증가가 15.7배였고 p53에 의해 억제된 E1A의 hTERT발현도 증가가 9.7배로서 38%감소하였다. 이상의 결과로부터 AGS세포주에서 p53이 E1A의 hTERT발현 촉진을 억제하는 효과는 최소한 hTERT promoter의 -941번부터 34번 염기사이 부분에 관련되는 것으로 판단된다. ③SaOS2세포주의 경우 골육종세포주인 SaOS2세포를 대상으로 한 luciferase assay결과 hTERT promoter전체부분(-1659번부터 34번 염기까지)에 대한 E1A의 hTERT발현도 증가가 5.1배였고 p53에 의해 억제된 E1A의 hTERT발현도 증가가2.5배로서 39%감소된 것과 비교할 때, hTERT promoter의 -1240번부터 34번 염기까지의 부분에 있어서 E1A의 hTERT발현도 증가가 3.7배였고 p53에 의해 억제된 E1A의 hTERT발현도 증가가 3.4배로서 8%감소하였다. hTERT promoter의 -941번부터 34번 염기까지의 부분에 있어 E1A의 hTERT발현도 증가가 3.8배였고 p53및 E1A의 hTERT발현도 증가가 4배로서 5%증가하였다. hTERT promoter의 -1037번부터 -248번 염기서열이 삭제된 나머지 부분에 있어 E1A의 hTERT발현도 증가가 1.5배였고 p53및 E1A의 hTERT발현도 증가가 2.2배로서 47%증가하였다. hTERT promoter의 -1016번부터 -53번 염기서열이 삭제된 나머지 부분에 있어 E1A의 hTERT발현도 증가가 2.6배였고 p53및 E1A의 hTERT발현도 증가가 3배로서 15%증가하였다. hTERT promoter의 -247번부터 34번 염기 사이의 부분에 있어 E1A의 hTERT발현도 증가가 1.9배였고 p53에 의해 억제된 E1A의 hTERT발현도 증가가 1.8배로서 5%감소하였다. hTERT promoter의 -80번부터 34번 염기 사이의 부분에 있어 E1A의 hTERT발현도 증가가 2.2배였고 p53및 E1A의 hTERT발현도 증가가 2.4배로서 9%증가하였다. hTERT promoter의 -25번부터 34번 염기 사이 부분에 있어 E1A의 hTERT발현도 증가가 3.1배였고 p53에 의해 억제된 E1A의 hTERT발현도 증가가 1.6배로서 48%감소하였다. 이상의 결과로부터 SaOS2세포에서 p53이 E1A의 hTERT발현 촉진을 억제하는 효과는 최소한 hTERT promoter의 -25번과 34번 염기사이 부분에 관련되는 것으로 판단된다.