CHO 세포에서 internal ribosome entry site를 이용한 재조합 사람 cytochrome p450 1A2 및 cytochrome 환원효소 동시발현에 의한 2-aminoanthracene의 대사활성화

Abstract

재조합 사람 cytochrome p450 1A2 (CYP1A2)와 cytochrome p450 환원효소 (CYPR)를 동시에 발현시키기 위하여 internal ribosome entry site (IRES)를 이용한 bicistronic construct (CYP1A2BC-RSV)를 제조한 다음 유전자전이 세포주 CHO.1A2BR.2662를 확립하였다. CHO.1A2BR.2662 microsome을 제조하여 Western blot을 시행한 결과 CYP1A2와 CYPR의 분자량은 각각 57kDa, 76kDa 이었다. Ethoxyresorufin O-deethylation assay로 CYP1A2의 효소활성도를 측정한 결과 21nmol/mg/ml 이었다. NADPH cytochrome c reductase 활성으로 CYPR의 효소활성도를 측정한 결과 30nmol/cytochrome c reduced/min/mg 이었다. 2-aminoanthracene (2-AA)이 미치는 세포독성을 측정한 결과 CHO.1A2BR.2662 세포주는 2-AA 50㎍/ml 이상에서 세포독성의 증가를 나타내었다 (p<0.05). 2-AA가 CHO.1A2BC-RSV에 미치는 유전독성을 측정하기 위하여 시행한 소핵시험에서 2-AA 0.5㎍/ml 까지 농도의존적으로 소핵 발생의 증가를 보였다 (p<0.05). 또한 single cell gel electrophoresis에서는 Komet 3.1™ 프로그램으로 DNA tail moment를 측정한 결과 2-AA 0.2㎍/ml까지 농도의존적으로 DNA 손상을 나타내었다 (p<0.05). 하지만 염색체이상시험에서는 2-AA에 의한 염색체이상의 증가는 관찰 할 수 없었다. 이상의 결과로 본 연구에서 수립된 CYP1A2및 CYPR 동시발현 CHO.1A2BR.2662 세포주는 CYP1A2에 의한 대사활성능을 발현하는 것을 알 수 있으며, 이는 앞으로 in vitro 대사활성화를 위한 독성검사 모델 및 cytochrome p450 작용기전 연구에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 추정된다.