Retroviral vector를 이용한 시토크롬 p450 3A4 및 환원효소 형질도입 Chinese hamster ovary 세포주 확립

Abstract

재조합 사람 cytochrome p450 3A4 (CYP3A4)와 cytochrome p450 환원효소 (CYPR)를 동시에 발현시키기 위하여 internal ribosome entry site (IRES)를 이용한 bicistronic retroviral plasmid (HCYP3A4BC4-LNCX2)를 제조하였다. Calcium phosphate 법으로 HCYP3A4BC4-LNCX2 플라스미드를 293GPG packaging 세포주에 transfection하여 retrovirus를 생산하고 Chinese hamster ovary (CHO) 세포주에 transduction하였다. Western blot으로 CYP3A4와 CYPR의 발현을 확인한 후 한계희석법으로 단세포클로닝 하여 유전자전이 세포주 CHO.3A4BC4-LNCX2를 확립하였다. CHO.3A4BC4-LNCX2 세포를 용해하여 Western blot을 시행한 결과 CYP3A4와 CYPR의 분자량은 각각 57kDa, 76kDa 이었다. 2-aminoanthracene (2AA), 2-amono-3,4-dimethyl-imidazo[4,5-f]quinoxaline (MeIQx), aflatoxin B1 (AFB1), aflatoxin B2 (AFB2) 및 aflatoxin G1 (AFG1)이 미치는 세포독성을 측정한 결과 CHO.3A4BC4-LNCX2 세포주는 100 μM 2AA, 25μM MeIQx, 0.5μM AFB1, 50μM AFB2 그리고 5μM AFG1 이상에서 이상에서 각각 세포독성의 증가를 나타내었다. 이상의 결과로 본 연구에서 수립된 CYP3A4 및 CYPR 연속발현 CHO.3A4BC4-LNCX2 세포주는 CYP3A4에 의한 대사활성능을 발현하는 것을 알 수 있으며, 이는 앞으로 in vitro 대사활성화를 위한 독성검사 모델 및 cytochrome p450 작용기전 연구에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 추정된다.