형질전환식물체 세대 간 항암단일항체 발현안정성

Abstract

본 실험은 형질전환된 담배로부터 세대가 거듭되더라도 항암 항체 유전자의 전달과 단백질의 발현에 변화가 없음을 확인하고자 수행되었다. 항암 항체 mAb CO17-1A를 발현하는 형질전환담배로부터 지속적인 자가수정을 통하여 얻은 씨앗에서 발아한 3세대와 4세대의 식물을 이용하였다. 형질전환된 담배 씨앗(3세대와 4세대)이 kanamycin이 포함된 배지에서 100% 발아 및 생장하는 것을 확인하였다. 이로써 3세대와 4세대 식물이 kanamycin에 내성이 있음을 알 수 있었으며, homozygous line임을 확인할 수 있었다. 약 16주 정도 키운 후 3세대와 4세대의 잎으로부터 genomic DNA를 추출하여 PCR을 수행한 결과 3세대 및 4세대의 식물에서 mAb CO17-1A의 중쇄(1.4kb)와 경쇄(0.7kb) 유전자가 모두 증폭됨을 관찰하였다. 즉, 세대가 거듭되더라고 유전자가 변이되지 않으며 안정하게 전이됨을 확인할 수 있었다. 또한 세대 번식을 통한 항체 단백질의 발현량을 확인하고자 3세대 및 4세대 식물의 잎으로부터 단백질을 추출하여 immunoblot을 수행한 결과 3세대 및 4세대 식물에서 중쇄(50kDa) 단백질이 동일한 density를 보였다. 이를 통해 세대가 거듭되더라도 항체를 생산하는 발현량에는 변화가 없음을 알 수 있었다. 위의 모든 결과를 바탕으로 형질전환 된 식물의 self-fertilization을 통하여 homozygous line의 세대번식이 이루어지며, 세대번식이 지속되더라도 그 유전자 및 발현량에는 변화가 없음을 확인할 수 있었다.

Recent plant biotechnology and advanced molecular immunology have established plant biopharming system as an alternative way to produce immunotherapeutic monoclonal antibodies. This plant production system is considered to have several advantages in safety and economical issues compared to other production systems. In this study, we confirmed stable gene insertion and expression of anti-cancer monoclonal antibody (mAb CO17-1A) in transgenic plants through subsequent generation. T-3 and T-4 generation of transgenic seeds were obtained by self-fertilization of homozygous transgenic line of T-2 and T-3 generation, respectively. T3 and T-4 seedlings showed 100% of germination and survival rate in MS media containing kanamycin whereas non-transgenic seedlings did not survive. PCR analysis showed that stable gene insertion of heavy and light chains of mAb CO17-1A in T-3 and T-4 transgenic plants. Immunoblot with densitometric analysis confirmed stable expression of mAb CO17-1A in both T-3 and T-4 transgenic plants. These results suggested that transgenes and expression of anti-cancer mAb CO17-1A are stably transferred and expressed in transgenic plants through subsequent generation by self fertilization, which is applicable to generate seed bank of homozygous transgenic line.