Internal ribosome entry site를 이용한 human cytochrome p450 1A1 및 cytochrome p450 reductase의 연속발현에 의한 대사활성 Chinese hamster ovary 세포주 확립

Abstract

재조합 사람 cytochrome p450 1A1 (CYP1A1)과 cytochrome p450 환원효소 (CYPR)를 동시에 발현시키기 위하여 internal ribosome entry site (IRES)를 이용한 bicistronic construct (HCYP1A1BC4-LNCX2)를 제조하였다. Calcium phosphate 법으로 HCYP1A1BC4-LNCX2 플라스미드를 293GPG packaging 세포주에 transfection하여 retrovirus를 생산하고 Chinese hamster ovary (CHO) 세포주에 transduction하였다. Western blot으로 CYP1A1과 CYPR의 발현을 확인한 후 한계희석법으로 단세포클로닝 하여 유전자전이 세포주 CHO.1A1BL.22를 확립하였다. CHO.1A1BL.22 microsome을 제조하여 Western blot을 시행한 결과 CYP1A1과 CYPR의 분자량은 각각 58kDa, 76kDa 이었다. 2-aminoanthracene (2-AA)이 미치는 세포독성을 측정한 결과 CHO.1A1BL.22 세포주는 2-AA 250μM 이상에서 세포독성의 증가를 나타내었다. 2-AA가 CHO.1A1BL.22에 미치는 유전독성을 측정하기 위하여 시행한 single cell gel electrophoresis에서는 Komet 4™ 프로그램으로 DNA tail moment를 측정한 결과 2-AA 0.1μM까지 농도의존적으로 DNA 손상을 나타내었다. 이상의 결과로 본 연구에서 수립된 CYP1A1 및 CYPR 연속발현 CHO.1A1BL.22 세포주는 CYP1A1에 의한 대사활성능을 발현하는 것을 알 수 있으며, 이는 앞으로 in vitro 대사활성화를 위한 독성검사 모델 및 cytochrome p450 작용기전 연구에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 추정된다.